【产品名称】

通用名称：DNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）

【包装规格】

货号：WLN8203KIT

规格：48份/盒

【原理概述】

本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸。依赖nfo酶的作用，加入根据模板设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。

【产品特点】

本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短（仅需12 min）等优点，反应组分为干粉状态，操作简便，易于保存。

本试剂对设备要求低，金属浴、水浴锅等即可进行反应操作，无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。

【引物设计】

建议使用长度在30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；下游引物的5’端标记一个修饰基团（常用生物素）。

引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。

【荧光探针设计】

在上下游引物中间，设计一段长度为46-52nt与目的片段互补的序列；5’端修饰一个抗原标记（典型FAM）;在5’端和3’末端的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为nfo的识别位点；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer等。

【试剂盒组成】

【试剂盒储存】

1．运输温度：≤ 20 ºC的恒温环境；

2．储存条件：储存温度 ≤ -20 °C（± 5 °C）恒温环境，避光保存，避免重压、反复冻融；

3．产品有效期：14个月；

4．生产日期见外包装。

【操作步骤】

提前30分钟将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。

(1) 每个干粉反应管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混匀，否则会对实验效果产生影响）；

(2) 每个反应管分别加入2 μL上游引物、  2 μL下游引物和0.6 μL探针（引物和探针浓度为10 μM，对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中）；

(3) 向反应管中依次加入2 μL ~ 13.5 μL核酸模板（可根据实际需求调整加入模板的体积，并相应调整加入的ddH₂O体积，至模板与ddH₂O总体积为13.5 μL）；

(4) 最后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（请务必上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀；对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧上下颠倒后混匀）；

(5) 混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中37-39 ºC孵育8-12 min；

(6) 反应结束后，取10 μL加入含有190 μL ddH₂O的离心管中，混合均匀后，将胶体金试纸条的样品端插入离心管中平衡，5 min内观察质控线与检测线判读结果。

体系配制

【注意事项】

1．由于试剂盒灵敏度非常高，在进行反应时请注意避免核酸污染，并设置空白对照；

2．使用时请取出实验所需的MIRA反应单元的数量，剩余部分请置于存储条件下。